Supernatural suit les aventures de deux frères, Sam et Dean Winchester (respectivement joués par Jared Padalecki et Jensen Ackles), chasseurs de créatures surnaturelles.

Sam et Dean sillonnent les États-Unis à bord d'une Chevrolet Impala noire de 1967 et enquêtent sur des phénomènes paranormaux (souvent issus du folklore, des superstitions, mythes et autres légendes urbaines américaines mais aussi des monstres surnaturels tels que les fantômes, loup garous, démons, vampires...). De manière générale, chaque épisode se déroule dans un lieu différent du pays et correspond à une enquête sur un phénomène paranormal. L'intrigue de la série a évolué au cours des différentes saisons.

La première saison raconte la réunion des deux frères et leurs efforts pour retrouver leur père ainsi que le démon responsable de la mort de leur mère 22 ans plus tôt et de celle de Jessica, la petite amie de Sam.

La deuxième saison est principalement centrée autour de Sam, les pouvoirs démoniaques qu'il développe et les plans que le démon aux yeux jaunes (Azazel) a prévu pour lui. Elle montre également les difficultés de Dean à accepter que son père se soit sacrifié pour le sauver.

Pendant la troisième saison, les deux frères cherchent désespérément un moyen de libérer Dean du pacte qu'il a passé avec un démon. Ce pacte, fait dans le but de ramener Sam à la vie, ne lui laisse qu'un an à vivre avant qu'il ne soit envoyé en Enfer.

Dans la quatrième saison, Dean, ramené parmi les vivants grâce à l'intervention des anges, a pour mission d'arrêter l'apocalypse. Il est aidé par Sam mais les relations entre les Winchester deviennent tendues quand Dean découvre que son frère lui ment et continue d'utiliser ses pouvoirs démoniaques.