Ezio Auditore da Firenze (Ezio du grec Aetos qui signifie aigle) ou tout simplement Ezio Auditore est un noble italien né en 1459 à Florence. À sa naissance, le bébé ne pleurait pas, mais son père lui soufflant quelque mots arriva finalement à pleurer et bien respirer. 17 ans plus tard, Ezio est un jeune adolescent qui vit à Florence, doué pour les acrobaties et séducteur. Il mène la belle vie dont les seuls problèmes seraient le garnement de la famille rivale Pazzi, Vieri, qui lui fera une cicatrice sur la lèvre supérieure pendant une bagarre de rue, et le père de la belle Cristina Vespucci qui les a surpris dans le lit de sa fille.
Mais un jour, sa vie bascule quand ses deux frères, Federico et Petruccio et son père Giovanni sont exécutés, victimes d'une conspiration. Dès lors, il ne lui reste quasiment plus de famille, seulement sa sœur Claudia Auditore et sa mère Maria Auditore qui perdra la parole suite à un choc émotionnel, due à l'arrestation musclée de son mari et de ses deux fils. Il décide alors de se réfugier chez son oncle Mario Auditore dans la Villa Auditore à Monteriggioni en Toscane, ville d'Italie, car désormais à Florence, tous ceux qui ont été proches de son père sont traqués et tués.
En sûreté dans la villa, Mario lui révèlera alors que toute sa famille est issue d'un ordre ancien appelé les Assassins, et qui combat toujours ses ennemis : les Templiers, les responsables de la mort de son père. Ezio se lance dans une quête de vengeance à travers l'Italie, entre la Toscane, la Romagne et Venise. Au fur et à mesure de sa longue vie, il se rend compte qu'une vérité plus grande que son objectif initial se cache derrière la grande conspiration.
Il s'allie avec Laurent de Médicis pour le soutien politique et reçoit l'aide de Léonard de Vinci qui décode les pages du Codex d'Altaïr et améliore les armes d'Ezio.
En 1499, Ezio infiltre le Vatican pour retrouver le Sanctuaire que Rodrigo Borgia, devenu le pape Alexandre VI, essaie d'ouvrir. Après leur combat dont Ezio sort vainqueur, il laisse une chance à Rodrigo, de survivre à sa vengeance ce qui débouche à l'attaque contre Monteriggioni. Ezio ouvre le sanctuaire et écoute au message de Minerve, dont le véritable destinataire est Desmond.
Ezio s'apprête à rendre les armes et à prendre du repos dans la résidence de sa famille à Monteriggioni, dans les bras de Caterina Sforza, quand Cesare Borgia, le fils du Pape, attaque de front la ville. Ezio fuit donc à Rome, où il reprend sa tâche d'Assassin, rappelle ses anciens camarades pour organiser la résistance et déclare la guerre aux forces de Cesare Borgia.
